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一种血清TPOABIGG4水平检测方法.pdf

摘要
申请专利号:

CN201610667954.7

申请日:

2016.08.15

公开号:

太阳城集团CN106257288A

公开日:

2016.12.28

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/96申请公布日:20161228|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/96申请日:20160815|||公开
IPC分类号: G01N33/96; G01N33/574; G01N33/68 主分类号: G01N33/96
申请人: 余洋
发明人: 高莹; 余洋; 张晶; 刘明明
地址: 100034 北京市西城区西什库大街8号北大医院第二住院部内科楼五层内分泌科
优先权:
专利代理机构: 北京国坤专利代理事务所(普通合伙) 11491 代理人: 姜彦
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法律状态
申请(专利)号:

CN201610667954.7

授权太阳城集团号:

||||||

法律状态太阳城集团日:

2018.06.05|||2017.01.25|||2016.12.28

法律状态类型:

太阳城集团发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

摘要

本发明公开了一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,包括如下步骤:S1、包板:用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml,各孔加50μl包被酶标板;S2、封闭:采用PBS‑T溶解的3%BSA封闭酶标板;S3、血清的稀释与检测:待测血清用PBS‑T以1:50稀释,各孔加入50μl,每份血清复孔检测,每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照;S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS‑T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4;S5、反应底物及终止反应:各孔加入50μl辣根酶的底物显色液,静置6~8分钟,显色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应,用酶标仪在490nm下测定各孔OD值;S6、数据处理:血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值,该方法能有效的检测血清TPOAb IgG4的水平,方法实施简单,可靠性强。

权利要求书

1.一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、包板:用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml,各孔加50μl包被酶标板;非
抗原包被孔加0.05mol/L碳酸盐缓冲液50μl,37℃孵育1小时,用PBS-T冲洗3次,拍干;
S2、封闭:采用PBS-T溶解的3%BSA封闭酶标板,各孔加250μl,37℃孵育1小时,用PBS-T
冲洗3次后,拍干;
S3、血清的稀释与检测:待测血清用PBS-T以1:50稀释,各孔加入50μl,每份血清复孔检
测,每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照,37℃孵育1小时,用PBS-T冲洗3次后,拍干;
S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS-T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4为二抗,37℃孵育1小
时,用PBS-T冲洗3次后,拍干;
S5、反应底物及终止反应:各孔加入50μl辣根酶的底物显色液,静置6~8分钟,显色后
各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应,用酶标仪在490nm下测定各孔OD值;
S6、数据处理:血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值。
2.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述
0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配制如下:将1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3粉碎混合;再加蒸
馏水定容至900ml,调pH值至9.6。
3.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述0.1%
PBS-T配制如下:将500ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液和0.5ml的Tween-20混合。
4.根据权利要求3所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述
0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制如下:将4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的
NaH2PO4·2H2O加蒸馏水定容至500ml,调pH值至7.2。
5.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述底物显
色液的配制方法为:在使用前5分钟内配制,将4mg的邻苯二胺、10ml的柠檬酸缓冲液和3%
过氧化氢溶液混合。
6.根据权利要求5所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述柠檬酸
缓冲液的配制方法为:将1.05mg的柠檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸馏水定容至150ml,
调pH值至5.0。
7.根据权利要求5所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述3%过
氧化氢溶液的配制方法为:将2ml的30%H2O2加蒸馏水定容至20ml。
8.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述1mol/L
盐酸配制方法为:将43.1ml的浓盐酸加蒸馏水定容至500ml。
9.根据权利要求1所述的一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,其特征在于,所述3%BSA
封闭液的配制方法为:将0.3g的BSA和10ml的0.01MPBS-T缓冲液混合。

说明书

一种血清TPOAb IgG4水平检测方法

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域,具体涉及一种血清TPOAb IgG4水平的检测方法。

背景技术

甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)是桥本甲状腺炎
(Hashimoto’s thyroiditis,HT)的标志性抗体,其能够通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒
作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)或补体依赖的细胞毒作
用(complement dependent cytotoxicity,CDC)损伤甲状腺细胞,因此在HT的发病机制中
发挥重要作用。TPOAb还能进一步干扰甲状腺过氧化物酶的催化作用,阻碍甲状腺激素的合
成,进而导致甲状腺功能减退(简称甲减)。

TPOAb主要为IgG型抗体。人IgG根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键数目、位置
的不同又可以分为四种亚型:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG4在血清中的含量最低,在IgG总
量中所占比例不足5%,平均浓度为0.35-0.51mg/mL。由于IgG4分子存在“半抗体转换”机制
导致“双特异性”IgG4抗体形成,其不能与抗原形成免疫复合物,且IgG4与C1q及Fc受体的亲
和力较低,不能进一步激活补体及介导免疫效应细胞的功能。基于上述特点,有学者认为
IgG4是一种非致病性抗体。

近年有研究报道,HT患者依据免疫组化染色结果可分为IgG4阳性及阴性HT。同
IgG4阴性HT相比,IgG4阳性HT患者年龄更小,病情进展更快,更容易出现甲减,组织病理上
纤维化程度更重。此外,有报道发现IgG4阳性HT患者中甲状腺乳头状癌(papillary
thyroid carcinoma,PTC)的发生率明显升高,且在IgG4阳性HT基础上发生的PTC预后更差。
综上所述,将HT患者进一步分为IgG4阳性及阴性两种免疫表型具有重要的临床意义,但目
前IgG4阳性HT的诊断仍依靠术后组织病理切片的免疫组化染色结果,而大部分HT患者并不
需要手术治疗,因此临床实践中迫切需要寻找并确定能够早期诊断IgG4阳性HT的无创性血
清学诊断指标。

在IGg4相关性疾病(IgG4-related diseases,IgG4-RD)的研究中,血清总IgG4浓
度大于135mg/dL是其血清学诊断标准。且在部分IgG4-RD患者中,血清IgG4浓度的变化与疾
病活动度相关。因此部分学者认为血清总IgG4可能可以作为无创性血清学方法应用于IgG4
阳性HT。但本研究组在前期工作中发现,IgG4阳性HT组中血清IgG4水平与IgG4阴性HT组相
比,差异无显著性,提示应用血清总IgG4水平并不能区分上述两种免疫表型。而IgG4阳性HT
组患者术前血清TPOAb的IgG4水平均明显高于IgG4阴性组。因此检测TPOAb IgG4水平可能
有助于鉴别这两种免疫表型,但目前国内外并无TPOAb IgG4的成熟检测方法。

发明内容

针对以上问题,本发明提供了一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,可以有效解决
背景技术中的问题。

为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:一种血清TPOAb IgG4水平检测
方法,包括如下步骤:

S1、包板:用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml,各孔加50μl包被酶标
板;非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸盐缓冲液50μl,37℃孵育1小时,用PBS-T冲洗3次,拍干;

S2、封闭:采用PBS-T溶解的3%BSA封闭酶标板,各孔加250μl,37℃孵育1小时,用
PBS-T冲洗3次后,拍干;

S3、血清的稀释与检测:待测血清用PBS-T以1:50稀释,各孔加入50μl,每份血清复
孔检测,每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照,37℃孵育1小时,用PBS-T冲洗3次后,拍
干;

S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS-T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4为二抗,37℃孵育
1小时,用PBS-T冲洗3次后,拍干;

S5、反应底物及终止反应:各孔加入50μl辣根酶的底物显色液,静置6~8分钟,显
色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应,用酶标仪在490nm下测定各孔OD值;

S6、数据处理:血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值。

根据上述技术方案,所述0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配制如下:将1.08g的Na2CO3和
2.95g的NaHCO3粉碎混合;再加蒸馏水定容至900ml,调pH值至9.6。

根据上述技术方案,所述0.1%PBS-T配制如下:将500ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲
液和0.5ml的Tween-20混合。

根据上述技术方案,所述0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制如下:将4.25g的NaCl、
2.901g的Na2HPO4·12H2O和0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸馏水定容至500ml,调pH值至7.2

根据上述技术方案,所述底物显色液的配制方法为:在使用前5分钟内配制,将4mg
的邻苯二胺、10ml的柠檬酸缓冲液和3%过氧化氢溶液混合。

根据上述技术方案,所述柠檬酸缓冲液的配制方法为:将1.05mg的柠檬酸和3.58g
的Na2HPO4·12H2O加蒸馏水定容至150ml,调pH值至5.0。

根据上述技术方案,所述3%过氧化氢溶液的配制方法为:将2ml的30%H2O2加蒸馏
水定容至20ml。

根据上述技术方案,所述1mol/L盐酸配制方法为:将43.1ml的浓盐酸加蒸馏水定
容至500ml。

根据上述技术方案,所述3%BSA封闭液的配制方法为:将0.3g的BSA和10ml的
0.01M PBS-T缓冲液混合。

本发明的有益效果:

本发明通过配制0.05mol/L碳酸盐缓冲液、0.1%PBS-T、底物显色液以及3%BSA封
闭液等溶液,将血清TPOAb依次经过包板、封闭、血清的稀释与检测、二抗、反应底物及终止
反应进行检测,该方法能有效的检测血清TPOAb IgG4的水平,方法实施简单,可靠性强。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明
进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于
限定本发明。

实施例:

一种血清TPOAb IgG4水平检测方法,包括如下步骤:

S1、包板:用0.05mol/L碳酸盐缓冲液将TPO稀释成2μg/ml,各孔加50μl包被酶标
板;非抗原包被孔加0.05mol/L碳酸盐缓冲液50μl,37℃孵育1小时,用PBS-T冲洗3次,拍干;

S2、封闭:采用PBS-T溶解的3%BSA封闭酶标板,各孔加250μl,37℃孵育1小时,用
PBS-T冲洗3次后,拍干;

S3、血清的稀释与检测:待测血清用PBS-T以1:50稀释,各孔加入50μl,每份血清复
孔检测,每块酶标板均设立空白、阳性和阴性对照,37℃孵育1小时,用PBS-T冲洗3次后,拍
干;

S4、二抗:各孔加入50μl用以PBS-T稀释的HRP标记的鼠抗人IgG4为二抗,37℃孵育
1小时,用PBS-T冲洗3次后,拍干;

S5、反应底物及终止反应:各孔加入50μl辣根酶的底物显色液,静置6~8分钟,显
色后各孔加50μl的1mol/L盐酸终止反应,用酶标仪在490nm下测定各孔OD值;

S6、数据处理:血清标本的OD值为抗原包被孔与相应的非抗原包被孔OD值的差值。

上述溶液的配制方法如下:

0.05mol/L碳酸盐缓冲液的配制如下:将1.08g的Na2CO3和2.95g的NaHCO3;再加蒸
馏水定容至900ml,调pH值至9.6。

0.1%PBS-T配制如下:将500ml的0.01mol/L磷酸盐缓冲液和0.5ml的Tween-20混
合。

0.01mol/L磷酸盐缓冲液的配制如下:将4.25g的NaCl、2.901g的Na2HPO4·12H2O和
0.296g的NaH2PO4·2H2O加蒸馏水定容至500ml,调pH值至7.2

底物显色液的配制方法为:在使用前5分钟内配制,将4mg的邻苯二胺、10ml的柠檬
酸缓冲液和3%过氧化氢溶液混合。

柠檬酸缓冲液的配制方法为:将1.05mg的柠檬酸和3.58g的Na2HPO4·12H2O加蒸馏
水定容至150ml,调pH值至5.0。

3%过氧化氢溶液的配制方法为:将2ml的30%H2O2加蒸馏水定容至20ml。

1mol/L盐酸配制方法为:将43.1ml的浓盐酸加蒸馏水定容至500ml。

3%BSA封闭液的配制方法为:将0.3g的BSA和10ml的0.01M PBS-T缓冲液混合。

基于上述,本发明的优点在于,本发明通过配制0.05mol/L碳酸盐缓冲液、0.1%
PBS-T、底物显色液以及3%BSA封闭液等溶液,将血清TPOAb依次经过包板、封闭、血清的稀
释与检测、二抗、反应底物及终止反应进行检测,该方法能有效的检测血清TPOAb IgG4的水
平,方法实施简单,可靠性强。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

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一种 血清 TPOABIGG4 水平 检测 方法
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